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基因型

产品说明

发根农杆菌是根瘤菌科(Rhizobiaceae)农杆菌属(agrobacterium)的一种革兰氏阴性土壤细菌，它能够感染大多数双子叶植物和少数单子叶植物以及个别裸子植物。ATCC15834发根农杆菌菌株来源于ATCC（美国模式培养物集存库/American type culture collection），为发根农杆菌原始菌株（wild strain），含有pRi15834农杆碱型Ri质粒，具有广泛的宿主范围（禾本科，豆科，烟草等），特别适合对紫杉醇，青蒿等药用植物毛状根的诱导。BFB生命科学的ATCC15834电转感受态细胞经特殊工艺制作，pCAMBIA2301质粒（卡那霉素抗性）检测，转化效率>1×10⁵ cfu/μg DNA。

操作方法

1. 0.1 cm电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟，待其沥干水分，正置5分钟，使乙醇充分挥发，待乙醇挥发干净立即插入冰中，压实冰面，电极杯顶离冰面0.5 cm以方便盖上杯盖，冰中静置5分钟充分降温。
2. 取-80℃保存的农杆菌感受态插入冰中5分钟，待其融化，加入0.01-1 μg质粒DNA（体积不大于6 ul，最好用试剂盒抽提，双蒸水溶解；转化效率较高，第一次使用前最好做预实验确定所加质粒的量），用手拨打管底混匀，立即插入冰中，用200 μl枪头将感受态-质粒混合物快速移到电击杯中，盖上杯盖，空管保留待用。
3. 启动电转仪，设置参数：C=25 μF，PC=200 ohm，V=2400 V（此参数为Biorad 推荐，使用者也可按所用电转仪推荐的protocol操作），将电击杯从冰中拿出，吸水纸吸干外表面水份，快速放入电转槽中，启动电击，电击完成快速插入冰中，加入1 ml无抗生素的TY，并转移到感受态空管中，28℃振荡培养2~3小时。
4. 6000 rpm离心一分钟收菌，留取100 μl 左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的TY平板上，倒置放于28℃培养箱培养2-3天。

备注

1. ATCC15834菌株质粒转化相关抗生素使用浓度：
   

   抗生素	配方	筛选培养基	原液	工作液
   硫酸卡那霉素（kan）	双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌	YMB或TY	100 mg/ml	100 μg/ml
   壮观霉素 (spec)	双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌	TY	50 mg/ml	70 μg/ml

    

2. 常用农杆菌抗性：（R：抗；S：敏感。）
   

   农杆菌菌株	羧苄青霉素(carb)	链霉素(strep)	利福平(rif)	氯霉素(cam)	硫酸卡那霉素(kan)
   Ar.A4	S	S	S	S	R
   MSU440	S	R	S	S	S
   Ar.Qual	S	R	S	R	S
   C58C1	S	R	R	S	S
   ATCC15834	S	S	S	S	S
   K599	S	R	S	S	S
   Ar.1193	R	R	R	S	S

 

3. YMB配方（1L）：
   

   Yeast extract	1 g
   MgSO4·7H2O	0.2 g
   K2HPO4	0.5 g
   NaCl	0.1 g
   甘露醇	10 g

   • 补水到1 L体积，完全溶解后，调PH值到7.0，121度、20分钟高温灭菌
   • 若配制YMB固体培养基，则加入15 g琼脂粉。

 

4. TY配方（1L）：
   

   Tryptone	5 g
   Yeast extract	3 g

   • 补水到1 L体积，完全溶解后，121度、20分钟高温灭菌。
   • 配制1 M的氯化钙水溶液，121度、20分钟高温灭菌。
   • 每1 L灭菌的TY液体营养液中加入10 ml无菌的1 M氯化钙水溶液即可。
   • 若配制TY固体培养基，则加入15 g琼脂粉。

注意事项

1. ATCC15834生长缓慢，转化质粒的ATCC15834菌涂布在含抗生素的平板上应生长72小时。
2. 加入质粒时体积不应大于感受态体积的1/10；质粒不纯或存在乙醇等有机物污染，转化效率急剧下降；质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。
3. 电转感受态细胞中不可混入气泡，转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
4. 平板上阳性克隆密度过大时，由于营养不足，阳性克隆生长变慢，菌落变小，为了获得大的菌落，应减少质粒用量或降低涂板的菌量。