产品规格
| BFNC86094-01 | 10×100 μl |
| BFNC86094-02 | 50×100 μl |
| BFNC86094-03 | 100×100 μl |
| pCAMBIA2301（control vector，10 ng/μl ) | 10 μl |
| 保存条件(保质期) | -80℃（12个月） |
基因型
产品说明
GV3101菌株为C58型背景，核基因中含有筛选标签——利福平抗性基因rif，为了便于转化操作，此菌株携带一无自身转运功能的胭脂碱型Ti质粒pMP90 (pTiC58DT-DNA)，此质粒含有vir基因 (vir基因是T-DNA插入植物基因组必需的元件，pMP90 (pTiC58DT-DNA)质粒自身的T-DNA转移功能被破坏，但可以帮助转入的双元载体T-DNA顺利转移)。pMP90 (pTiC58DT-DNA)型Ti 质粒含有筛选标签：gent，赋予GV3101菌株庆大霉素抗性，适用于拟南芥、烟草、玉米、土豆等植物的转基因操作，BFB生命科学的GV3101感受态细胞经特殊工艺制作，pCAMBIA2301质粒检测转化效率>1×104 cfu/μg DNA。
操作方法
- 取-80℃保存的农杆菌感受态于室温或手心片刻待其部分融化，处于冰水混合状态时插入冰中。
- 每100 μl感受态加入0.01-1 μg质粒DNA（转化效率较高，第一次使用前最好做预实验确定所加质粒的量），用手拨打管底混匀，依次于冰上静置5分钟、液氮5分钟、37℃水浴5分钟、冰浴5分钟。
- 加入700 μl无抗生素的LB或YEB液体培养基，于28℃振荡培养2~3小时。
- 6000 rpm离心一分钟收菌，留取100 μl左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培养箱培养2-3天（当平板只含有50 μg/ml kan 时，28℃培养48 h即可；平板中同时加入50 μg/ml kan，20 μg/ml rif 时，需28℃培养60 h；如果使用的平板含有50 μg/ml rif 则需要28℃培养72-90 h）。
注意事项
- 加入质粒时体积不应大于感受态体积的1/10；质粒不纯或存在乙醇等有机物污染，转化效率急剧下降；质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。
- 混入质粒时应轻柔操作。转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
- 平板上阳性克隆密度过大时，由于营养不足，阳性克隆生长变慢，菌落变小，为了获得大的菌落，应减少质粒用量。
- 利福平浓度不应高于25 μg/ml，过高的利福平浓度不利于农杆菌生长，会降低其生长速度和转化效率。本公司感受态计算转化效率时所用平板只含有50 μg/ml kan，若所用平板含有20 μg/ml rif则转化效率降低到1/2。
- 培养基中加入利福平的目的是防止杂菌生长、筛选农杆菌；根据所用菌株抗性加入Ti质粒筛选抗生素可防止Ti质粒丢失，但Ti质粒筛选抗生素不利于农杆菌的转基因操作，所以一般培养农杆菌时不考虑这些抗生素，Ti质粒丢失的概率极低(可以忽略)。
备注
- 农杆菌相关抗生素配方：
抗生素 配方 原液 工作液 羧苄青霉素（carb） 双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 50 mg/ml 50 μg/ml 硫酸卡那霉素（kan） 双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 50 mg/ml 50 μg/ml 链霉素（strep） 双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 10 mg/ml 50 μg/ml 利福平（rif） DMSO溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 10 mg/ml 20 μg/ml 庆大霉素（gent） 双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 20 mg/ml 40 μg/ml - 常用农杆菌抗性：（R：抗；S：敏感。）
农杆菌菌株 羧苄青霉素(carb) 链霉素(strep) 利福平(rif) 庆大霉素(gent) 硫酸卡那霉素(kan) AGL-1 R S R S S EHA101 S S R S R EHA105 S S R S S LBA4404 S R R S S GV3101 S S R R S - LB及YEB配方：
component LB(液体)/L LB(固体)/L component YEB(液体)/L YEB(固体)/L Tryptone 10 g 10 g Tryptone 5 g 5 g Yeast extract 5 g 5 g Yeast extract 1 g 1 g NaCl 10 g 10 g 牛肉浸膏 5 g 5 g NaOH 调PH到7.0 调PH到7.0 蔗糖 5 g 5 g Agar – 15 g MgSO4*7H2O 0.49 g 0.49 g NaOH 调PH到7.0 调PH到7.0 Agar – 15 g