产品规格

基因型

产品说明

TOP10电转感受态细胞只能用于电击转化，不能用于热激转化。TOP10来源于MC1061菌株，是目前实验室最常用的感受态细胞之一，基因型与DH10B高度类似 (DH10B为galE15型，而TOP10为galU型)。TOP10生长速度快 (比DH5α快，但比Mach1-T1生长速度慢)，10小时可见克隆。recA1和endA1的突变有利于插入DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。可用于构建克隆，蓝白斑筛选等实验。BFB生命科学的TOP10电转感受态细胞经特殊工艺制作，pUC19质粒检测转化效率可达1×10¹⁰ cfu/μg DNA。

操作方法

1. 0.1 cm 电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟，待其沥干水分，正置5分钟，使乙醇充分挥发，待乙醇挥发干净立即插入冰中，压实冰面，电极杯顶离冰面0.5 cm以方便盖上杯盖，冰中静置5分钟充分降温。
2. 取-80℃保存的TOP10电转感受态细胞插入冰中5 分钟，待其融化，加入目的DNA (质粒或连接产物)并用手拨打EP管底轻轻混匀，避免产生气泡，立即插入冰中。
   1. 测定转化效率使用1 μl 10 pg/μl的对照质粒 pUC19；
   2. 对于连接产物，请用乙醇沉淀DNA后加入适量TE缓冲液 (10mM Tris HCl, pH7.5; 1mM EDTA)重悬，DNA浓度不超过100ng/μl，体积不超过5μl/50μl 感受态。
3. 用200 μl枪头(用刀切除0.5cm枪尖)将感受态-DNA混合物快速移到电击杯中，避免产生气泡，盖上杯盖。
4. 启动电转仪，设置参数：C=25 μF，PC=200 Ω，V=1.8 kV (此为BioRad 电转仪推荐参数，也可按所用电转仪推荐的参数操作），将电击杯快速放入电转槽中，电击完成快速插入冰中。
5. 2分钟后从冰中取出电击杯，放室温，加入1ml不含抗生素的无菌S.O.C. 培养基（室温），用1ml枪吹吸电击杯底部数次混匀后，转移到50 ml离心管（BD Falcon 50 ml锥形离心管等），向离心管中补加S.O.C. 培养基至10 ml。倾斜45度放入摇床，37℃，225 rpm复苏60分钟。
6. 5000 rpm离心一分钟收菌，重悬后取100-200 μl涂布到含相应抗生素的S.O.C平板上（因菌量较大，若全部涂板请选用直径15cm培养皿2-5个）。将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养13-17小时。

S.O.C 培养基配方

S.O.C. Medium is suitable for use in the final step of cell transformation to obtain maximal transformation efficiency of E. coli (Hanahan, 1983).

注意事项

1. 加入DNA时体积不应大于感受态体积的1/10。
2. 电转感受态细胞加入电击杯应避免产生气泡，气泡会增加弧光放电风险。
3. 当DNA不纯或存在盐，乙醇，蛋白及缓冲液等污染时，转化效率急剧下降。
4. 电击杯里的离子可增加溶液的电导，增大在含有细胞和DNA的溶液中产生电流和弧光放电的风险。
5. 若转化大质粒或想获得较高转化效率，推荐使用高纯质粒提取试剂盒提取质粒。质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。
6. 对于连接产物转化，最好转化前乙醇沉淀DNA后用适量TE缓冲液(10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重悬产物，保证DNA浓度不超过100 ng/μl。过高浓度连接产物或过大体积连接产物会降低转化效率，增加弧光放电的风险。
7. 混入质粒时应轻柔操作，吸取感受态细胞时不可用孔径过小的枪头 (普通200ul枪头应剪去枪头尖0.6cm) 避免用力过猛，以免剪切力过大损伤细胞膜，降低转化效率。转化高浓度的质粒或连接产物可相应减少最终用于涂板的菌量。
8. 电转感受态细胞最好保存在-80℃以下，高于-80℃超期储存会导致转化效率会下降。